扩大短内容排序空间小说RNA-Sequencing图书馆准备工作流

新型短内容测序仪承诺增加对RNA序列的访问

随着新的短内容测序平台的引入,比赛破坏下一代测序(上天)市场已经开始,用快速、准确和可负担得起的测序仪可以提供替代的主要商业“sequencing-by-synthesis”工具。结果,研究人员现在可以选择从这些新平台分析RNA转录准确的表达在RNA序列(RNA-seq)。

这里我们展示提高访问RNA-seq如何履行其潜在益处转化研究和总结小说如何RNA图书馆准备化学可以使收购健壮的数据从这些新的测序平台,和概要文件的样本类型,与思想进一步的创新领域。

RNA-seq的好处可以提供实用工具在许多应用领域。基础科学研究中广泛采用RNA-seq可能导致更好的基因组,因此一个注释提高对许多新基因的功能的理解。

发现RNA-seq也显示出独特的临床优势,特别是在生物标志物检测和分析肿瘤蛋白表达在formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)样本,这可以说是最常见的存档biospecimen可用。在最近的一项研究,发现大脑肿瘤的基因融合FFPE样本的下一代mRNA测序导致决定性诊断相关性在43%的情况下,在40%的情况下,融合基因的检测提供了一种对那些病人制药靶点。

限制在脑部肿瘤的诊断和治疗,这种结果尤为重要。这样的进步并不局限于脑部肿瘤。例如,RNA-seq临床应用于乳腺癌支持的预测预后和其他结果。使更多的发现这样的要求引入更多的互动平台,使RNA-seq可用于更广泛的研究人员的数量。给出改进的可访问性,这些新平台可以在新发现的潜在的发展援助,或使临床测序应用预测诊断。

RNA序列库制备技术的角色混乱

确保这些潜在新短内容测序平台的使用超出了仪器购买价格,RNA隔离和测序试剂。它还需要RNA图书馆准备试剂,使高质量的测序结果广泛的样本条件。

图书馆准备是RNA-seq和涉及到转换的关键一步的互补的RNA。一个适配器连接步骤介绍了序列的3 '末端的RNA转录合成第一链cDNA期间使用的逆转录酶。随后,放大,大小选择特定的片段和清理,之后cDNA图书馆可以运行在音序器。测序运行后,读取长度的50 - 300碱基对(bp)分别进行了分析和组装到一个全基因组序列使用开放获取脚本在生物信息学分析。确定记录检测,分析比较了数据管道的参考基因组物种。

RNA序列需要适合的样本类型以确保广泛的采用。虽然许多库选项可用准备新鲜的样品和孤立的细胞培养;固定的组织,比如FFPE样品,仍然是一个挑战对于RNA质量要求高的许多商业RNA-seq图书馆准备工具。RNA隔绝FFPE往往是低质量的,因为它往往是严重退化和化学改性交联固定。鉴于绝大多数肿瘤活检作为FFPE存储,能够使用从固定组织RNA序列将允许更大的访问从最常见的测序数据归档标本类型。因此,为FFPE样品开发协议将使许多样品档案的使用价值的临床研究。

使整个FFPE样本的转录组分析方法

为了解决FFPE的挑战,最近的一项研究评估了红杉完成链RNA图书馆准备装备FFPE,与领先的商业工具,捕捉的全转录组,包括长期和短期RNA生物型,在乳腺癌样本。红杉工作流使用红杉完整的工具包,后跟一个小说post-library方法去除核糖体RNA-derived cDNA片段红杉RiboDepletion工具包。组确认,RNA-seq图书馆准备使用红杉工作流可以迅速提供短期和长期rna从一个工作流,克服固有的偏见其他商业工具,只有抓住了特定尺寸范围的rna。优先研究的速度和易用性,红杉资本链RNA表达图书馆准备工具包提供了一个快速的3小时,3-tube工作流,检测从高质量的RNA RNA样本。

红杉完成和红杉表达工具消除共同挑战与RNA-seq首先消除偏见引入典型的多步酶过程。使用单一工程逆转录转座子(即。,SEQzyme红杉工作流),代替传统的逆转录酶和连接酶中发现标准pre-libary ribo-depletion策略消除了偏见造成的多步酶促过程,并产生更像是源转录组的互补脱氧核糖核酸数据库。此外,SEQzyme使改进的持续和端到端模板跳通过使用一个连续合成反应,RNA转化为互补,既增加了测序适配器在一个单一的步骤。此外,在红杉完整包格式,RNA片段首先腺苷酸,然后满怀polythymidine序列的3 '末端测序适配器。结果,长期(> 200个基点)和短期(< 200个基点)RNA转录可以捕获在一个图书馆工作流程。

红杉工作流的第二个优点是,post-library ribodepletion策略保留其转换后由消耗核糖体RNA转录组丰富cDNA、点样时更稳定。这些独特的属性确保一个更健壮的过程导致了更完整的转录组分析。

总的来说,这项工作表明RNA-seq解锁新的分子机制的承诺,在未来,biologically-driven研究可能发生即使FFPE和其他退化和/或低产RNA样本。

需要进一步的创新解决RNA序列的挑战

而新的测序平台和健壮的试剂推动的采用利用RNA-seq技术的应用程序这个过程的上游和下游,许多其他方面需要创新。RNA-Seq也是分子分析工作流的一部分。例如,RNA-seq搭配数字PCR和qPCR允许更广泛的发现过程的确认使用离散小板在一大群快速实现样品,一旦相关生物过程的目标识别。

关键领域商业焦点可能受益,甚至改变RNA测序工作流程包括:

• 消除生物信息学瓶颈提供了集成的计算工具和资源与新的测序技术对小和长rna
• 改善RNA提取试剂,确保稳定、高质量的RNA在足够水平的收益率将从样品处理降低降解RNA的风险。
• 样品池96库运行在一个管显著提高产能
• 自动化和简化RNA-seq图书馆准备更高的吞吐量和标准化
• RNA-seq数据确认使用正交的分子技术,如数字PCR和qPCR
• 扩张的参考基因组非哺乳类物种,例如常见的农作物和病原体
• 克服更大的负担能力障碍测序深度在数十亿——大大增加读取每样的数量可以确定低级,以前无法觉察的成绩单
• 使用单细胞RNA-seq在多元异质的细胞类型特异的结果来确定组织微环境艾滋病发育生物学、神经科学和肿瘤
• 强劲的发展,具有成本效益的读测序能够处理大片段到1000个基点以上,评估更多的RNA转录组,和融合蛋白,短内容音序器的无法检测。

它也是至关重要的,确保RNA-seq图书馆准备包很容易适合转录组分析一系列样本类型不同RNA输入,并兼容新的短内容测序平台,允许转让现有的工作流这些新工具或开发新的。例如,最近的研究已开展展示小说的兼容性RNA-seq图书馆准备上面讨论新定序器平台(图1 + 2),包括元素生物科学“AVITI平台和奇异基因组学”G4系统。

它也是至关重要的,确保RNA-seq图书馆准备包很容易适合转录组分析一系列样本类型不同RNA输入,并兼容新的短内容测序平台,允许转让现有的工作流这些新工具或开发新的。例如,最近的研究已开展展示小说的兼容性RNA-Seq图书馆准备上面讨论新定序器平台(图1和图2),包括元素生物科学“AVITI平台和奇异基因组学”G4系统。

图1:红杉完整库元素AVITI系统上运行产生一致的测序结果在漫长的RNA转录检测样本复制和不同的RNA(左)和输入水平也发现小RNA转录(100 ng)高或低(10 ng) RNA的输入(右)。来源:Bio-Rad。

图2:红杉资本链RNA表达库运行在单一G4提供检测更长的RNA转录与领先的商用台式测序相比,对高(100 ng)和低(10 ng) RNA的输入。来源:Bio-Rad。

通过这种策略,不仅可以用户更多的负担得起的测序的桥梁,但他们也可以获得可靠的数据竞争对手领先的商用台式测序平台。取决于所使用的工具,研究人员可以获得完整的转录组概要文件的样本以较低的成本和精力,和获得高质量的数据即使从FFPE高度退化的RNA样品使用。或者速度和方便是一个重要的考虑因素,使用更快库预备工作流程可以确保工作完成在4小时。

优秀的图书馆准备是关键核糖核酸测序技术的进步

RNA-seq革命性的时代RNA分析在不到十年的时间,允许研究向未知的打造方面的转录组和描述基本生物过程和疾病状态。改善这种独特的技术在未来十年将有助于实现其全部潜力的生物和转化研究。

关于作者

Nish库马尔是全球高级产品经理在Bio-Rad基因表达组。她有一个强大的基因组背景和新产品开发工作的想法。

琳达Lingelbach是全球的营销经理基因表达在Bio-Rad营销集团,负责把小说总会在图书馆准备工具和qPCR耗材市场研究人员可以完成更多的与他们的研究。

当归•奥尔科特是全球的高级应用程序经理基因表达在Bio-Rad营销集团。她喜欢支持营销努力创建引人入胜的技术含量和工作与关键领域的研究人员准备和多路复用qPCR RNA-Sequencing图书馆。

有娘娘腔的江是一个高级全球产品经理主要商业产品营销努力Bio-Rad实验室的RNA序列库准备产品组合。她在基因表达分析和对技术创新的热情努力使Bio-Rad捷领域革命性的产品。